Mikrob kulturalarini yaratish: Global laboratoriyalar va tadqiqotchilar uchun keng qamrovli qo'llanma

Mikrob kulturalari fundamental tadqiqotlar va biotexnologiyadan tortib, atrof-muhit fanlari va klinik diagnostikagacha bo'lgan keng ko'lamli ilmiy fanlar uchun asosiy vositadir. Mikroorganizmlarni in vitro sharoitida muvaffaqiyatli yetishtirish qobiliyati ularning xususiyatlarini o'rganish, tajribalar o'tkazish va yangi ilovalarni ishlab chiqish uchun zarurdir. Ushbu keng qamrovli qo'llanma mikrob kulturalarini yaratish va saqlashda ishtirok etadigan tamoyillar va amaliyotlarni, butun dunyo laboratoriyalari uchun dolzarb bo'lgan eng yaxshi amaliyotlar, nosozliklarni bartaraf etish va xavfsizlik masalalariga e'tibor qaratgan holda batafsil bayon qiladi.

Mikrob kulturalarini tushunish

Mikrob kulturalari nima?

Mikrob kulturasi - bu mikroorganizmlarni nazorat qilinadigan laboratoriya sharoitida oldindan belgilangan ozuqa muhitida ko'payishiga imkon berish orqali ko'paytirish usulidir. Mikroorganizmlarga bakteriyalar, zamburug'lar, viruslar, sodda hayvonlar va suv o'tlari kiradi. Kulturalar faqat bir turdagi organizmni o'z ichiga olgan sof yoki bir nechta turni o'z ichiga olgan aralash bo'lishi mumkin.

Nima uchun mikrob kulturalari muhim?

Tadqiqot: Mikroblar fiziologiyasi, genetikasi va xulq-atvorini o'rganish.
Diagnostika: Klinik namunalardagi patogenlarni aniqlash.
Biotexnologiya: Farmatsevtika, fermentlar va boshqa qimmatli mahsulotlarni ishlab chiqarish.
Atrof-muhit fanlari: Tuproq, suv va havodagi mikrob jamoalarini tahlil qilish.
Ta'lim: Asosiy mikrobiologik usullarni o'rgatish.

Asosiy uskunalar va materiallar

Muvaffaqiyatli mikrob kulturalari laboratoriyasini tashkil etish bir qator maxsus uskunalar va materiallarni talab qiladi:

Inkubatorlar: Optimal mikrob o'sishi uchun barqaror harorat va namlikni saqlash. CO2 inkubatorlari ko'pincha nazorat qilinadigan CO2 darajasini talab qiladigan eukariotik hujayra kulturalari uchun ishlatiladi.
Avtoklavlar: Ozuqa muhitlari, uskunalar va chiqindilarni yuqori bosimli bug' yordamida sterilizatsiya qilish.
Laminar oqim shkaflari (Biologik xavfsizlik shkaflari): Kulturalar bilan ishlash uchun steril muhitni ta'minlash, kontaminatsiya xavfini kamaytirish. Biologik xavfsizlik shkaflarining turli sinflari (I, II, III-sinf) foydalanuvchi, namuna va atrof-muhit uchun turli darajadagi himoyani taklif qiladi.
Mikroskoplar: Mikroblar morfologiyasini kuzatish va kultura sofligini baholash. Fazali-kontrastli mikroskopiya tirik, bo'yalmagan hujayralarni ko'rish uchun ayniqsa foydali bo'lishi mumkin.
Chayqatgichlar/Aralashtirgichlar: Suyuq kulturalarni aeratsiya va aralashtirishni ta'minlab, bir tekis o'sishni rag'batlantirish.
Pipetkalar va mikropipetkalar: Suyuqliklarni aniq o'tkazish.
Petri likopchalari va probirkalar: Mos ravishda qattiq va suyuq kulturalar uchun idishlar.
Steril tamponlar va halqalar: Kulturalarni ko'chirish va shtrixlash uchun.
Ozuqa muhitlari: Mikroblarning o'sishi uchun ozuqa moddalarini ta'minlash.
Shaxsiy himoya vositalari (SHV): Shaxsiy xavfsizlikni ta'minlash uchun qo'lqoplar, laboratoriya xalatlari, ko'z himoyasi va niqoblar.

Ozuqa muhitlarining turlari

Ozuqa muhitini tanlash muvaffaqiyatli mikrob kultivatsiyasi uchun juda muhimdir. Muhitlar tarkibi, konsistensiyasi va maqsadiga qarab tasniflanishi mumkin.

Tarkibiga ko'ra

Aniq tarkibli muhit (Sintetik muhit): Aniq ma'lum bo'lgan kimyoviy komponentlarni o'z ichiga oladi. Maxsus ozuqa talablarini o'rganish uchun foydali. Misol: E. coli uchun M9 minimal muhiti.
Murakkab tarkibli muhit (Tabiiy muhit): Achitqi ekstrakti, pepton yoki go'sht ekstrakti kabi kimyoviy tarkibi noma'lum bo'lgan ingredientlarni o'z ichiga oladi. Keng ko'lamli ozuqa moddalarini ta'minlaydi va ko'plab mikroorganizmlarning o'sishini qo'llab-quvvatlaydi. Misol: Ozuqali bulyon yoki Luria-Bertani (LB) bulyoni.

Konsistensiyasiga ko'ra

Qattiq muhit: Qattiqlashtiruvchi modda, odatda agarni o'z ichiga oladi. Sof kulturalarni ajratib olish va koloniya morfologiyasini kuzatish uchun ishlatiladi. Misol: Ozuqali agar yoki MakKonki agari.
Suyuq muhit (Bulyon): Qattiqlashtiruvchi moddani o'z ichiga olmaydi. Ko'p miqdordagi mikroorganizmlarni o'stirish uchun ishlatiladi. Misol: Triptik soya bulyoni (TSB).
Yarim qattiq muhit: Kam konsentratsiyadagi agarni o'z ichiga oladi (odatda <1%). Harakatchanlikni sinash uchun ishlatiladi.

Maqsadiga ko'ra

Selektiv (tanlovchi) muhit: Ayrim mikroorganizmlarning o'sishini to'xtatib, boshqalarining o'sishiga imkon beradigan ingredientlarni o'z ichiga oladi. Aralash populyatsiyadan ma'lum turdagi mikroorganizmlarni ajratib olish uchun ishlatiladi. Misol: MakKonki agari (gram-manfiy bakteriyalarni tanlaydi) yoki Mannitol tuzli agar (MSA), u Staphylococcus turlarini tanlaydi va mannitol fermentatsiyasiga asoslanib *Staphylococcus aureus* ni boshqa *Staphylococcus* lardan farqlaydi.
Differensial (farqlovchi) muhit: Turli xil mikroorganizmlarni ularning metabolik faoliyatiga qarab ajratishga imkon beradigan ingredientlarni o'z ichiga oladi. Misol: Qonli agar (bakteriyalarni gemolizga qarab farqlaydi) yoki Eozin Metilen Ko'ki (EMK) agari, u *E. coli* (yaltiroq yashil tus) va boshqa koliform bakteriyalarni farqlaydi.
Boyituvchi muhit: Muayyan mikroorganizmning o'sishini rag'batlantiradigan, unga namunadagi boshqa organizmlardan ustun kelishiga imkon beradigan maxsus ozuqa moddalarini o'z ichiga oladi. Ular maqsadli organizm kam miqdorda mavjud bo'lganda ishlatiladi. Misol: *Salmonella* turlarini boyitish uchun ishlatiladigan selenit bulyoni.

Misol: *E. coli* kulturasi uchun to'g'ri muhitni tanlash *E. coli* ning umumiy kulturasini o'stirish uchun odatda LB bulyoni yoki agari ishlatiladi. Agar siz laktozani fermentlay oladigan *E. coli* shtammlarini tanlamoqchi bo'lsangiz, MakKonki agarini ishlatishingiz mumkin. Agar siz maxsus metabolik yo'llarni o'rganayotgan bo'lsangiz, mavjud ozuqa moddalarini nazorat qilish uchun M9 kabi aniq tarkibli muhitdan foydalanishingiz mumkin.

Mikrob kulturasini yaratish bosqichlari

Mikrob kulturasini yaratish jarayoni odatda quyidagi bosqichlarni o'z ichiga oladi:

1. Ozuqa muhitini tayyorlash

Ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga yoki o'rnatilgan laboratoriya protokollariga muvofiq tegishli ozuqa muhitini tayyorlang. Bu odatda quyidagilarni o'z ichiga oladi:

Kerakli ingredientlarni tortish.
Ingredientlarni distillangan yoki deionizatsiyalangan suvda eritish.
pH ni kerakli darajaga sozlash.
Agar qo'shish (agar qattiq muhit tayyorlanayotgan bo'lsa).
Muhitni avtoklavlash orqali sterilizatsiya qilish.

Muhim jihatlar:

Aniqlik: Takrorlanuvchan natijalar uchun aniq o'lchovlar juda muhimdir. Kalibrlangan tarozilar va o'lchov shisha idishlaridan foydalaning.
Sterillik: Kontaminatsiyani oldini olish uchun barcha muhit komponentlari va tayyorlash idishlari steril ekanligiga ishonch hosil qiling.
pH ni sozlash: Muhitning pH darajasini kalibrlangan pH-metr yordamida tekshiring. Aksariyat bakteriyalar neytral pH (taxminan 7.0) yaqinida optimal o'sadi. Zamburug'lar ko'pincha biroz kislotali sharoitlarni afzal ko'radi.

2. Sterilizatsiya

Sterilizatsiya kulturani ifloslantirishi mumkin bo'lgan har qanday istalmagan mikroorganizmlarni yo'q qilish uchun zarurdir. Umumiy sterilizatsiya usullari quyidagilarni o'z ichiga oladi:

Avtoklavlash: 121°C da 15-20 daqiqa davomida yuqori bosimli bug'dan foydalanish. Bu muhitlarni, uskunalarni va chiqindilarni sterilizatsiya qilishning eng keng tarqalgan usuli.
Filtrli sterilizatsiya: Suyuqliklarni mikroorganizmlarni olib tashlash uchun yetarlicha kichik teshikli (odatda 0.22 mkm) filtrdan o'tkazish. Avtoklavlash mumkin bo'lmagan issiqlikka sezgir eritmalar uchun ishlatiladi. Misol: Antibiotik eritmalarini sterilizatsiya qilish.
Quruq issiqlik bilan sterilizatsiya: 1-2 soat davomida yuqori haroratdan (160-180°C) foydalanish. Shisha idishlar va boshqa issiqlikka chidamli buyumlarni sterilizatsiya qilish uchun ishlatiladi.
Kimyoviy sterilizatsiya: Yuzalar va uskunalarni sterilizatsiya qilish uchun etanol yoki xlorli oqartiruvchi kabi kimyoviy dezinfektsiyalovchi vositalardan foydalanish.

Avtoklavlash uchun eng yaxshi amaliyotlar:

Avtoklavning to'g'ri saqlanishi va kalibrlanganligiga ishonch hosil qiling.
Avtoklavni ortiqcha yuklamang.
Qaynashning oldini olish uchun suyuqliklarni avtoklavlashda tegishli idishlardan foydalaning.
Kuyishning oldini olish uchun ochishdan oldin avtoklavning to'liq sovishini kuting.

3. Inokulyatsiya (ekish)

Inokulyatsiya - bu kerakli mikroorganizmni steril ozuqa muhitiga kiritish jarayonidir. Bu inokulyum manbai va tayyorlanayotgan kultura turiga qarab turli usullar yordamida amalga oshirilishi mumkin.

Sof kulturadan: Mavjud kulturaning oz miqdorini steril halqa yoki tampon yordamida yangi muhitga o'tkazish.
Aralash kulturadan: Izolyatsiya uchun shtrixlash orqali qattiq muhitda alohida koloniyalarni ajratib olish.
Klinik namunadan: Namunani muhitga surtish yoki namunani suyuq muhitda suspenziya qilish.
Atrof-muhit namunalaridan: Sanash mumkin bo'lgan koloniyalarni olish uchun seriyali suyultirish va ekish usullaridan foydalanish.

Izolyatsiya uchun shtrixlash: Bu usul aralash bakteriyalar populyatsiyasidan sof kulturalarni olish uchun ishlatiladi. U bakterial namunani qattiq agar likopchasi yuzasi bo'ylab qayta-qayta shtrixlash orqali suyultirishni o'z ichiga oladi. Maqsad, har biri bitta bakterial hujayradan kelib chiqqan yaxshi ajratilgan koloniyalarni olishdir.

Misol: *E. coli* ni izolyatsiya uchun shtrixlash 1. Halqani qizarguncha alangalantirib, so'ng sovutib sterilizatsiya qiling. 2. Halqani *E. coli* o'z ichiga olgan namunaga botiring. 3. Halqani agar likopchasining bir qismi bo'ylab shtrixlang. 4. Halqani yana alangalantiring va sovuting. 5. Birinchi qismdan ikkinchi qismga, ba'zi bakteriyalarni birga sudrab shtrixlang. 6. Uchinchi va to'rtinchi qismlar uchun alangalantirish va shtrixlash jarayonini takrorlang. 7. Likopchani 37°C da 24-48 soat davomida inkubatsiya qiling. Ajratilgan koloniyalar shtrixning keyingi qismlarida hosil bo'lishi kerak.

4. Inkubatsiya

Inkubatsiya mikrob o'sishi uchun tegishli atrof-muhit sharoitlarini ta'minlashni o'z ichiga oladi. Bu odatda quyidagilarni nazorat qilishni o'z ichiga oladi:

Harorat: Aksariyat bakteriyalar 37°C da (inson tanasi harorati) optimal o'sadi, ammo ba'zilari pastroq yoki yuqoriroq haroratni talab qilishi mumkin. Zamburug'lar ko'pincha pastroq haroratni (25-30°C) afzal ko'radi.
Atmosfera: Ba'zi mikroorganizmlar kislorodning mavjudligi yoki yo'qligi yoki karbonat angidridning yuqori darajasi kabi maxsus atmosfera sharoitlarini talab qiladi. Aerob bakteriyalar o'sish uchun kislorodga muhtoj, anaerob bakteriyalar esa kislorodga chiday olmaydi.
Namlik: Yetarli namlikni saqlash muhitning qurib qolishini oldini oladi.
Vaqt: Inkubatsiya vaqti mikroorganizm va ozuqa muhitiga qarab o'zgaradi. Bakteriyalar odatda zamburug'larga qaraganda tezroq o'sadi.

Inkubatsiya bo'yicha mulohazalar:

Haroratni nazorat qilish: Aniq harorat nazoratini ta'minlash uchun kalibrlangan inkubatorlardan foydalaning.
Atmosfera nazorati: Maxsus atmosfera sharoitlarini yaratish uchun anaerobik bankalar yoki CO2 inkubatorlaridan foydalaning.
Monitoring: Kulturalarni o'sish va kontaminatsiya uchun muntazam ravishda kuzatib boring.

5. Monitoring va saqlash

Kulturaning to'g'ri o'sayotganligini va kontaminatsiyadan xoli ekanligini ta'minlash uchun muntazam monitoring zarur. Bu quyidagilarni o'z ichiga oladi:

Vizual tekshiruv: Suyuq muhitda xiralik yoki qattiq muhitda koloniya hosil bo'lishi kabi o'sish belgilarini tekshirish.
Mikroskopik tekshiruv: Hujayra morfologiyasini kuzatish va kultura sofligini baholash. Gram bo'yicha bo'yash bakteriyalarni farqlashning keng tarqalgan usuli hisoblanadi.
Subkultivatsiya (qayta ekish): Hayotiylikni saqlash va ozuqa moddalarining tugashini oldini olish uchun kulturaning bir qismini yangi muhitga o'tkazish.
Saqlash: Muzlatish yoki liofilizatsiya (muzlatib quritish) orqali kulturalarni uzoq muddatli saqlash uchun saqlash.

Aseptik usul: Kontaminatsiyaning oldini olish

Aseptik usul - bu kulturalarning kontaminatsiyasini oldini olish va steril muhitni saqlash uchun mo'ljallangan protseduralar to'plamidir. Aseptik usulning asosiy tamoyillari quyidagilarni o'z ichiga oladi:

Laminar oqim shkafida ishlash: Steril ish joyini ta'minlash.
Uskunalarni sterilizatsiya qilish: Halqalar va ignalarni alangalantirish, muhit va shisha idishlarni avtoklavlash.
Steril materiallardan foydalanish: Oldindan sterilizatsiya qilingan bir martalik materiallardan foydalanish yoki qayta ishlatiladigan materiallarni ishlatishdan oldin sterilizatsiya qilish.
Havoga ta'sirni kamaytirish: Kulturalarning havoga ta'sir qilish vaqtini kamaytirish uchun tez va samarali ishlash.
To'g'ri qo'l gigienasi: Kulturalar bilan ishlashdan oldin va keyin qo'llarni yaxshilab yuvish.

Amalda aseptik usul misollari:

Steril Petri likopchasini ochish: Havoga ta'sirni kamaytirish uchun qopqog'ini faqat biroz ko'taring.
Kulturani ko'chirish: Kulturani ko'chirishdan oldin va keyin probirkaning og'zini alangalantiring.
Muhit tayyorlash: Steril suv va shisha idishlardan foydalaning va tayyorlangandan so'ng darhol muhitni avtoklavlang.

Keng tarqalgan muammolarni bartaraf etish

Ehtiyotkorlik bilan rejalashtirish va amalga oshirishga qaramay, mikrob kulturalarini yaratishda ba'zan muammolar yuzaga kelishi mumkin. Quyida ba'zi keng tarqalgan muammolar va ularning yechimlari keltirilgan:

O'sish yo'q:
- Mumkin bo'lgan sabab: Noto'g'ri ozuqa muhiti, noto'g'ri inkubatsiya harorati, hayotiy bo'lmagan inokulyum, ingibitorlarning mavjudligi.
- Yechim: Ozuqa muhiti mikroorganizm uchun mos ekanligini tekshiring, inkubatsiya haroratini tekshiring, yangi inokulyumdan foydalaning va muhitda ingibitorlar yo'qligiga ishonch hosil qiling.
Kontaminatsiya:
- Mumkin bo'lgan sabab: Yomon aseptik usul, ifloslangan muhit yoki uskunalar, havodagi ifloslantiruvchilar.
- Yechim: Aseptik usulni ko'rib chiqing va kuchaytiring, barcha muhit va uskunalarni to'g'ri sterilizatsiya qiling va laminar oqim shkafida ishlang. Kontaminantlarning o'sishini bostirish uchun muhitda (kerak bo'lganda) antibiotiklar yoki antifungallardan foydalaning.
Sekin o'sish:
- Mumkin bo'lgan sabab: Optimal bo'lmagan o'sish sharoitlari, ozuqa moddalarining kamayishi, zaharli qo'shimcha mahsulotlarning to'planishi.
- Yechim: O'sish sharoitlarini (harorat, atmosfera, pH) optimallashtiring, yangi muhit bilan ta'minlang va zaharli qo'shimcha mahsulotlarni olib tashlash uchun kulturani aeratsiya qiling.
Aralash kultura:
- Mumkin bo'lgan sabab: Asl inokulyumning ifloslanishi, shtrixlash paytida to'liq bo'lmagan izolyatsiya.
- Yechim: Ishonchli manbadan sof kultura oling, izolyatsiya uchun shtrixlashni takrorlang va istalmagan mikroorganizmlarning o'sishini bostirish uchun selektiv muhitdan foydalaning.

Xavfsizlik choralari

Mikroorganizmlar bilan ishlash xodimlarni himoya qilish va potentsial zararli organizmlarning atrof-muhitga chiqishini oldini olish uchun qat'iy xavfsizlik protokollariga rioya qilishni talab qiladi.

Biologik xavfsizlik darajalari

Mikroorganizmlar kasallik keltirib chiqarish potentsialiga qarab biologik xavfsizlik darajalariga (BXD) tasniflanadi. Har bir BXD maxsus saqlash amaliyotlari va xavfsizlik uskunalarini talab qiladi.

BXD-1: Sog'lom kattalarda kasallik keltirib chiqarmaydigan mikroorganizmlar. Misol: Bacillus subtilis. Standart mikrobiologik amaliyotlar va SHV talab qiladi.
BXD-2: O'rtacha kasallik xavfini tug'diradigan mikroorganizmlar. Misol: Staphylococcus aureus. BXD-1 amaliyotlari, shuningdek, cheklangan kirish, biologik xavf haqida ogohlantiruvchi belgilar va o'tkir asboblar bilan ehtiyot choralari talab qilinadi. Aerozollar bilan ishlash biologik xavfsizlik shkafida o'tkazilishi kerak.
BXD-3: Nafas olish yo'li bilan jiddiy yoki o'limga olib kelishi mumkin bo'lgan kasalliklarni keltirib chiqaradigan mikroorganizmlar. Misol: Mycobacterium tuberculosis. BXD-2 amaliyotlari, shuningdek, nazorat ostidagi kirish, yo'naltirilgan havo oqimi va nafas olish himoyasi talab qilinadi. Barcha ishlar biologik xavfsizlik shkafida o'tkazilishi kerak.
BXD-4: O'ta xavfli va hayot uchun xavfli kasallik xavfi yuqori bo'lgan mikroorganizmlar. Misol: Ebola virusi. BXD-3 amaliyotlari, shuningdek, to'liq izolyatsiya, maxsus ventilyatsiya tizimlari va to'liq tanani himoya qiluvchi kostyumlar talab qilinadi.

Umumiy xavfsizlik amaliyotlari

Tegishli SHV kiying: Qo'lqoplar, laboratoriya xalatlari, ko'z himoyasi va niqoblar.
Yaxshi qo'l gigienasiga rioya qiling: Kulturalar bilan ishlashdan oldin va keyin qo'llarni yaxshilab yuving.
Ish yuzalarini zararsizlantiring: Ishlatishdan oldin va keyin yuzalarni tegishli dezinfektsiyalovchi bilan tozalang.
Chiqindilarni to'g'ri yo'q qiling: Ifloslangan chiqindilarni avtoklavlang yoki yoqing.
To'kilishlar va baxtsiz hodisalar haqida xabar bering: To'kilishlarni tozalash va xabar berish uchun belgilangan protokollarga rioya qiling.
To'g'ri ta'lim oling: Barcha xodimlar mikrobiologik usullar va xavfsizlik tartib-qoidalari bo'yicha o'qitilganligiga ishonch hosil qiling.

Kulturalarni uzoq muddatli saqlash

Mikrob kulturalarini uzoq muddatli saqlash qimmatli shtammlarni saqlab qolish va organizmlarni qayta-qayta ajratib olish va kultivatsiya qilish zaruratidan qochish uchun juda muhimdir. Umumiy saqlash usullari quyidagilarni o'z ichiga oladi:

Sovutgichda saqlash: Kulturalarni qisqa muddatli saqlash uchun (haftalardan oylargacha) 4°C da saqlash.
Muzlatish: Kulturalarni -20°C yoki -80°C da glitserin kabi krioprotektiv moddada saqlash. Bu usul kulturalarni yillar davomida saqlashi mumkin.
Liofilizatsiya (Muzlatib quritish): Kulturadan suvni muzlatish va keyin vakuum ostida quritish orqali olib tashlash. Bu usul kulturalarni o'n yillar davomida saqlashi mumkin.

Kulturalarni muzlatish uchun eng yaxshi amaliyotlar:

Hujayralarga zarar yetkazishi mumkin bo'lgan muz kristallari hosil bo'lishini oldini olish uchun krioprotektiv moddadan foydalaning. Glitserin keng tarqalgan krioprotektiv modda hisoblanadi.
Hujayralardan suv chiqishiga imkon berish uchun kulturalarni sekin muzlating. Nazorat qilinadigan tezlikdagi muzlatgichdan foydalaning yoki kulturalarni -80°C ga o'tkazishdan oldin bir necha soat davomida -20°C muzlatgichga qo'ying.
Muzlatilgan kulturalarni havo o'tkazmaydigan qopqoqli krioviallarga saqlang.
Viallarni shtamm nomi, muzlatilgan sana va boshqa tegishli ma'lumotlar bilan aniq belgilang.

Xulosa

Mikrob kulturalarini yaratish va saqlash butun dunyodagi tadqiqotchilar, klinisyenlar va o'qituvchilar uchun asosiy mahoratdir. Aseptik usul tamoyillarini tushunish, tegishli ozuqa muhitini tanlash va to'g'ri xavfsizlik protokollarini amalga oshirish orqali siz turli xil ilovalar uchun mikroorganizmlarni muvaffaqiyatli yetishtirishingiz mumkin. Ushbu qo'llanma mikrob kulturalari texnikasi bo'yicha tajribangizni oshirish va turli ilmiy sohalardagi yutuqlarga hissa qo'shish uchun keng qamrovli asos yaratadi. Yodda tutingki, izchil amaliyot, tafsilotlarga sinchkovlik bilan e'tibor berish va xavfsizlikka sodiqlik ishonchli va takrorlanuvchan natijalarga erishish uchun zarurdir.